Saccharomyces boulardii – единственный гриб, используемый в клинической практике в качестве пробиотика [1]. Saccharomyces boulardii могут конкурировать с сальмонеллами и шигеллами за сайты адгезии в кишечнике, тем самым уменьшая колонизацию кишечной стенки патогенами и сокращая нишу для выживания патогенов в кишечнике [2]. Кроме того, метаболиты, продуцируемые S. boulardii, существенно подавляют секрецию патогенных токсинов и поддерживают здоровье кишечника. Saccharomyces boulardii способны расщеплять токсины, продуцируемые Clostridium difficile и Escherichia coli, путем продукции протеаз [3, 4]. Кроме того, S. boulardii высвобождает в просвет кишечника полиамины, что приводит к повышению секреции эпителиальными клетками микроворсинок ферментов мембраны щеточной каемки, включая лактазу, сахаразу, изомальтозу и другие ферменты, расщепляющие дисахариды. Это способствует росту кишечных ворсинок и улучшению пищеварения и всасывания, а также улучшает работу антител, направленных против кишечных патогенов [5].

Уникальные пробиотические свойства S. boulardii позволили использовать их для лечения синдрома раздраженного кишечника, диареи и бактериальных заболеваний кишечника, а также в качестве биологически активной добавки к пище. Во многих исследованиях продемонстрировано значительное увеличение пищевой ценности продуктов, ферментированных S. boulardii. S. boulardii увеличивают функциональную ценность пищи и улучшают состав микробиоты кишечника, стабилизируя pH и кислотность пищи на длительный период [6].

Saccharomyces boulardii способствуют обогащению пищи биологически активными изофлавонами, снижают уровень антипитательной фитиновой кислоты и увеличивают биодоступность пищевых минералов. Установлено, что содержание лигнина из активных красителей в соевом молоке, ферментированном с использованием S. boulardii в сочетании с различными молочнокислыми бактериями, увеличивается с 97,49 до 98,49%, а содержание дайдзеина – с 62,5 до 92,31% [7]. В процессе ферментации рисовых отрубей S. boulardii выделяются токоферол, полифенолы, инозитолгексафосфат, некрахмальные полисахариды, оризанол и фитостеролы, которые могут ингибировать рост злокачественных лимфом [8]. Содержание фенольных соединений и антиоксидантные свойства овощного сока, ферментированного с использованием S. boulardii, также значительно улучшаются [9]. Эти исследования свидетельствуют о том, что для получения потенциально биологически активных соединений во время роста S. boulardii, благодаря их пробиотической функции, можно использовать различные субстраты. Однако полученные таким образом соединения имеют сложную структуру, и исчерпывающие данные о биологической активности внеклеточных метаболитов S. boulardii недоступны.

Saccharomyces boulardii — это дрожжи, выделенные из кожуры личи, произрастающего на полуострове Индокитай. Они похожи на Saccharomyces cerevisiae, но представляют собой другую разновидность сахаромицет, которая отличается классификацией, метаболизмом и происхождением [10]. Достигнут значительный прогресс в описании различий между S. boulardii и S. cerevisiae, к примеру, различий в процессе роста при разных температурах и pH. Однако доступны лишь отдельные сообщения о различиях в устойчивости к условиям среды желудочно-кишечной тракта, кишечной адгезии, антиоксидантной активности и внеклеточных метаболитах S. cerevisiae и S. boulardii. Изучение пробиотических свойств и внеклеточных метаболитов S. boulardii позволит использовать S. boulardii в качестве сконструированного штамма в пищевой и фармацевтической промышленности. Цель данного исследования состояла в изучении пробиотических свойств S. boulardii in vitro, а также их внеклеточных метаболитов и функциональных свойств и в сравнении их со свойствами S. cerevisiae.

Химические реактивы

Реагенты и растворители аналитической чистоты были приобретены в Тяньцзиньском институте химических реактивов (Тяньцзинь, Китай). 2,2-Дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ), соль желчных кислот свиньи и метиленовый синий были приобретены у компании «Solabio» (Пекин, Китай). Ацетонитрил и метанол для хроматографии были приобретены у кампании «Merck» (Дармштадт, Германия).

Микроорганизмы и условия роста

Saccharomyces boulardii получали из пробиотических капсул (S. boulardii + Mos) производства компании «Jarrow Industries Inc.» (Лос-Анджелес, США) и хранили в среде YPD (2% декстроза, 2% пептон, 1% дрожжевой экстракт) при 4°С/ Штамм F15 Saccharomyces cerevisiae выделяли из винной закваски (компания «Laffort», Франция), а штаммы S. cerevisiae ATCC9080, ATCC9763 и CICC1398 хранили в лаборатории. Пять штаммов дрожжей культивировали во встряхивающем инкубаторе при 180 об/мин и температуре 30°С.

Эксперимент по моделированию условий желудочно-кишечного тракта in vitro

Saccharomyces cerevisiae и S. boulardii культивировали в течение ночи в среде YPD. После ночной инкубации полученную культуру (оптическая плотность при длине волны 600 нм [OD₆₀₀] = 1,0) центрифугировали (3000×g, 10 мин), дважды промывали стерильным физиологическим раствором и помещали в среду, имитирующую среду желудочно-кишечного тракта, при 37°C следующим образом:

1. Saccharomyces cerevisiae и S. boulardii культивировали в водном растворе (pH 2,0), содержащем 3 г/л пепсина (3200–4500 Ед/мг) и 5 г/л NaCl, в течение 0, 0,5, 1, 1,5 или 2 ч.

2. Saccharomyces cerevisiae и S. boulardii культивировали в водном растворе (pH 8,0), содержащем 1 г/л трипсина (903 Ед/мг) и 5 г/л NaCl, в течение 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 ч.

3. Раствор с дрожжевыми клетками в фазе экспоненциального роста разбавляли до OD₆₀₀ 1,0 и капельно инокулировали 5 мкл разбавителя в твердую среду YPD с концентрацией солей желчных кислот 0,15, 0,25, 0,5, 0,75 и 1%.

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью камеры Нейбауэра («Quking Co. LTD.», Шанхай, Китай) путем прижизненного окрашивания метиленовым синим.[11]. Для оценки жизнеспособности дрожжей использовали следующее уравнение (1):

где I% — выживаемость, А — общее количество дрожжевых клеток, а — количество мертвых клеток при окрашивании метиленовым синим, а A – a – выживаемость.

Оценка гидрофобности

Diana et al. [12] оценивали гидрофобность клеточной поверхности с помощью хлороформа и н-гексадекана. 3 мл суспензии дрожжей инкубировали с 0,75 мл хлороформа или гексадекана. Полученную смесь перемешивали в течение 2 мин и выдерживали при 37°С в течение 1 ч. Затем измеряли оптическую плотность водной фазы при длине волны 600 нм, и результаты выражали в процентах гидрофобности в соответствии с уравнением (2):

где S% – аутоагрегация, A_T – оптическая плотность раствора в разные моменты времени, A₀ – оптическая плотность раствора в момент времени 0 ч.

Антиоксидантное действие

Используя описанный ранее метод [13], свежую культуру дрожжей (3000×g, 10 мин) получали путем центрифугирования, промывки и суспендирования в физиологическом растворе (0,9% хлорида натрия). Супернатант, полученный путем центрифугирования, пропускали через фильтр из ацетата целлюлозы 0,22 мкм и разбавляли в 10 раз. Суспензию дрожжей (2 мл) переносили в новую пробирку с 2 мл раствора ДФПГ (раствор этанола 0,2 мМ), объединяли вещества путем полного перемешивания в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали (6000×g, 10 мин) и 2 мл супернатанта переносили в колориметрическую чашку для определения оптической плотности при длине волны 517 нм, используя стерильную воду в качестве контроля. Антиоксидантную активность разведенного супернатанта определяли тем же методом. Скорость захвата ДФПГ выражали в процентах, используя следующее уравнение (4):

где A_{517(образец) –} оптическая плотность исследуемого образца при длине волны 517 нм, а A_{517(контроль) –} оптическая плотность контрольного раствора при длине волны 517 нм.

Антибактериальные эффекты метаболитов S. boulardii

Супернатанты дрожжей стерилизовали с помощью фильтрующей мембраны из ацетата целлюлозы 0,22 мкм и лиофилизировали. Затем сухое вещество повторно растворяли в стерильной воде до десятикратного разведения.

Используя ранее опубликованный метод [14], чашки Петри, оксфордские чашки и другие материалы перед использованием стерилизовали в стерилизаторах высокого давления. Сначала суспензии бактерий (Escherichia coli ATCC 25,922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Shigella flexneri CMCC(B)51,572, Listeria monocytogenes ATCC19115 и Salmonella typhimurium ATCC14028, все в концентрации 10⁷ КОЕ/мл) равномерно распределяли на агаризованной среде с питательным бульоном, приготовленной в чашке Петри. Затем на поверхность культуры ставили оксфордскую чашку и добавляли каплю концентрата. После этого бактерии культивировали при температуре 37°C в течение 18 часов и оценивали диаметр зоны подавления роста, чтобы определить антибактериальную активность различных образцов. рН концентрированного супернатанта доводили до 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 или 8,0, добавляя растворы HCl 1 моль/л и NaOH 1 моль/л. После поддержания соответствующего значения рН в течение 1 часа pH концентрированного супернатанта возвращали к исходному и определяли антибактериальную активность. Образцы обрабатывали трипсином, пепсином, папаином и протеиназой К. Раствор фермента доводили до концентрации 1 г/л, оптимальные значения рН ферментов были следующими: пепсин – 2,0; трипсин 7,0; папаин 8,0; и протеаза К, 7,5. Для определения антибактериальной активности раствор фермента и супернатант смешивали в равных объемах. Перед оценкой антибактериального действия значение рН концентрированного супернатанта возвращали к исходному уровню, а в качестве контроля использовали концентрированный супернатант без ферментативной обработки.

Кривая роста S. boulardii и антибактериальная активность метаболитов в разные моменты времени

Saccharomyces boulardii культивировали в течение ночи до середины фазы логарифмического роста (OD₆₀₀ ≈ 1) и инокулировали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую среду YPD в пропорции 1%. Ферментацию проводили во встряхиваемых колбах при температуре 30°С и 180 об/мин. Каждые 2 часа в полученном ферментационном бульоне определяли pH и количество жизнеспособных клеток. Из ферментационного бульона брали небольшой образец и определяли оптическую плотность. Кривую роста строили по времени взятия образцов. Для определения количества живых дрожжевых клеток использовали планшет Нойбауэра для подсчета клеток крови и метод окрашивания живых клеток метиленовым синим [11]. Полученные значения использовали в качестве индикаторов для оценки метаболизма и биомассы дрожжей. В качестве контроля использовали чистую среду. В то же время ферментационный бульон лиофилизировали и концентрировали для определения антибактериальной активности. Опыты повторяли трижды.

Экстракция внеклеточных метаболитов

Клетки дрожжей культивировали в течение ночи до достижения OD₆₀₀ около 1,0, после чего 100 мл 1%-ного раствора переносили в треугольную колбу объемом 250 мл, содержащую полную среду SD (азотистое основание для дрожжей, 2% глюкозу, 0,5% NH₄SO₄, все аминокислоты), и центрифугировали при температуре 30°С и 180 об/мин. Клетки дрожжей культивировали во встряхивателе до достижения неподвижной фазы. Супернатант центрифугировали и пропускали через фильтрующую мембрану из ацетата целлюлозы 0,22 мкм. В качестве исследуемого образца использовали бесклеточный ферментативный бульон S. boulardii и S. cerevisiae, а в качестве контрольного образца – исходную среду. Образец хранили при температуре –80°C для последующего анализа.

Сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография с технологией Orbitrap
Экстракционная масс-спектрометрия (ВЭЖХ‑QE‑МС)

Экстракцию метаболитов из образцов проводили методом СВЭЖХ-QE-МС (сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография с с технологией Orbitrap – экстракционная масс-спектрометрия) в соответствии с ранее опубликованным методом [15]. 100 мкл образца переносили в пробирку Эппендорфа. После добавления 400 мкл экстракта (ацетонитрил:метанол = 1:1, содержащий меченную изотопом смесь внутреннего стандарта) образцы встряхивали в течение 30 с, обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин на ледяной бане и инкубировали в течение 1 ч при температуре ‑40°C для осаждения белков. Затем образцы центрифугировали при 12 000 об/мин (13 800 × g, R = 8,6 см) в течение 15 мин при температуре 4°C. Полученный супернатант переносили в новый стеклянный флакон для анализа.

Жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) проводили с использованием системы сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии [СВЭЖХ](Vanquish, Thermo Fisher Scientific) с колонкой СВЭЖХ BEH Amide (2,1 мм × 100 мм, 1,7 мкм), соединенной с масс-спектрометром Q Exactive HFX (Orbitrap MS, Thermo). Подвижная фаза состояла из 25 ммоль/л ацетата аммония и 25 гидроксида аммония в воде (рН = 9,75; А) и ацетонитрила (В). Температура в автоматическом пробоотборнике составляла 4°C, а объем пробы – 3 мкл. Использовали масс-спектрометр QE HFX, учитывая его способность получать спектры МС/МС в информационно-зависимом режиме сбора данных под управлением программного обеспечения для сбора данных (Xcalibur, Thermo). В этом режиме программное обеспечение непрерывно оценивало полный спектр МС. Использовали следующие настройки источника ESI: скорость потока покровного газа 30 Arb; Скорость потока вспомогательного (aux) газа 25 Arb; температура на капилляре 350°С; разрешение масс-спектрометра 60 000; разрешение МС/МС 7500; энергия столкновения 10/30/60 в режиме NCE; напряжение распылителя 3,6 кВ (в режиме регистрации положительных ионов) или – 3,2 кВ (в режиме регистрации отрицательных ионов) [16]. Было проведено шесть параллельных экспериментов.

Обработка данных СВЭЖХ-QE-МС и маркировка метаболитов

Для обнаружения пиков, оценки извлечения, выравнивания и интеграции необработанные данные были преобразованы в формат mzXML с помощью ProteoWizard и обработаны в собственной программе, разработанной с использованием R и основанной на XCMS. Затем для маркировки метаболитов использовали внутренний стандарт базы данных MS2 (BiotreeDB). Для маркировки установили пороговое значение на уровне 0,3 [17].

Статистический анализ

Для анализа данных использовали программное обеспечение SPSS 22 (Armonk, NY, USA). Две группы данных сравнивали с использованием t-критерия, а множество групп данных – методом однофакторного дисперсионного анализа. Для множественных сравнений использовали критерий Дункана. Для создания тепловой карты, гистограммы и линейного графика использовали программное обеспечение R и GraphPad prism (Хэмптон, Массачусетс, США).

Каждый эксперимент проводили трижды, если не указано иное.

Устойчивость пробиотиков к симулированным условиям желудочно-кишечного тракта in vitro

В таблице 1 описана жизнеспособность различных штаммов дрожжей в искусственном желудочном соке. Мертвых клеток S. boulardii не наблюдалось, и их выживаемость оставалась на уровне 100%. Значимые различия в выживаемости, по сравнению с клетками штамма ATCC9080 (P > 0,05), отсутствовали. Выживаемость штамма F15 через 120 мин снизилась, а через 3 часа составила 92,75 ± 0,83%. Через 1 ч выживаемость двух штаммов начала снижаться; конечная выживаемость штамма ATCC9763 составила 88,33 ± 0,39%, а штамма CICC1398 — 87,76 ± 0,64%.

Рост колоний различных штаммов дрожжей в среде, содержащей разные соли желчных кислот, представлен на рис. 1а. Колонии ATCC9763, CICC1398 и F15 постепенно уменьшались и становились видимыми. При этом колонии штамма ATCC9080 S. boulardii сохраняли высокую устойчивость к солям желчных кислот при концентрации солей желчных кислот 1%, что указывает на то, что S. boulardii обладает более высокой устойчивостью к солям желчных кислот, чем большинство других штаммов Saccharomyces.

Показатели выживаемости пяти штаммов дрожжей в моделируемой кишечной среде представлены в таблице 2. Saccharomyces boulardii также обладают высокой стабильностью. Выживаемость составила 100% через 0‑2 часа и 93,35% через 3 часа. Значимые различия между выживаемостью S. boulardii и CICC1398, ATCC9763, ATCC9080 и F15, отсутствовали. Таким образом, всесторонний анализ показал, что S. boulardii были наиболее устойчивы к симулированным условиям желудочно-кишечного тракта, за ними следуют штаммы ATCC9080 и F15.

Способность к аутоагрегации
Способность пяти штаммов дрожжей к самагрегации описана на рис. 1b. Значимые различия в скорости аутоагрегации между штаммами ATCC9763, CICC1398 и ATCC9080 через 0–12 часов отсутствовали (P> 0,05). Способность S. boulardii к аутоагрегации на ранних стадиях была слабой, но с увеличением времени культивирования она значительно возрастала, достигая 95,1 ± 0,19%, что свидетельствовало о сходстве S. boulardii и S. cerevisiae и в целом о высокой способности к аутоагрегации. Скорость аутоагрегации грибов штамма F15 начала увеличиваться через 0–6 ч, но значимые изменения после 6 ч отсутствовали (P > 0,05). При этом способность к аутоагрегации у представителей этого штамма в целом была ниже, чем у других штаммов дрожжей. В целом кишечная адгезия S. boulardii была ниже, чем у S. cerevisiae, что указывает на то, что S. boulardii с трудом колонизирует кишечник.

Гидрофобность клеточной поверхности дрожжей

Гидрофобность клеточной поверхности пяти штаммов дрожжей описана на рис. 1c. Гидрофобность S. boulardii составила 34,62 ± 0,22%, и уступает показателям гидрофобности штаммов ATCC9763 (66,89 ± 0,03%), CICC1398 (67,28 ± 0,3%) и ATCC9080 (66,86 ± 0,02%). Самой низкой гидрофобностью обладал штамм F15 (29,1 ± 0,15%). Таким образом, S. boulardii не обладает высокой гидрофобностью и характеризуется меньшей адгезией, по сравнению с S. cerevisiae.

Антиоксидантные свойства

Мы изучили скорости поглощения свободных радикалов ДФПГ клеточными и бесклеточными супернатантами пяти штаммов дрожжей (рис. 1d). Скорость захвата свободных радикалов ДФПГ S. boulardii достигала 67,0 ± 0,13%, и была намного выше, чем у других четырех штаммов.

Скорость захвата свободных радикалов ДФПГ бесклеточным супернатантом S. boulardii достигла 69,8 ± 0,08%, что была значительно выше, чем у четырех штаммов S. cerevisiae (P <0,05). Это говорит о том, что S. boulardii обладает сильными антиоксидантными свойствами, а также может продуцировать антиоксидантные метаболиты после ферментации.

Антибактериальные свойства

Мы получили внеклеточные метаболиты S. boulardii и изучили их антибактериальные свойства в отношении пяти распространенных пищевых патогенов. Наиболее выраженное подавление роста E. coli обеспечивали бесклеточные экстракты S. boulardii, при этом F15 и 9763 не проявляли антибактериальных свойств (рис. 2a). Спектр антибактериального действия внеклеточных метаболитов S. boulardii представлен на рис. 2b. Бесклеточный экстракт S. boulardii проявлял антибактериальные свойства в отношении патогенов пищевого происхождения. Наиболее выраженным было подавление роста E. coli – диаметр зоны подавления составил 15,43 ± 0,26 мм. Метаболиты S. boulardii были предварительно изучены, и диаметры зон подавления роста при использовании бесклеточных супернатантов S. boulardii, обработанных различными протеазами при различных значениях pH, представлены в таблице S1. Достоверной разницы в диаметре зоны подавления роста при рН 2–4 и рН > 4 не отмечено. При увеличении рН до 5 диаметр зоны подавления роста значительно уменьшался – антибактериальная активность концентрата начинала снижаться. Супернатант полностью утрачивал антибактериальную активность при рН 6–8, что свидетельствует о существенном влиянии рН на антибактериальную активность концентрированного раствора (Р > 0,05). При добавлении протеазы антибактериальная активность концентрированного супернатанта S. boulardii значительно снижалась, но не исчезала полностью. Это указывает на то, что внеклеточные метаболиты S. boulardii обладают противомикробными свойствами; однако основными антимикробными метаболитами являются соединения небелковой природы. С увеличением времени ферментации pH постепенно снижался до 4, и через 12 ч не наблюдалось значительных изменений (P>0,05) (рис. 3a). Кривая роста S. boulardii и диаметр зоны ингибирования на разных стадиях роста представлены на рис. 3b. Через 6 ч колонии S. boulardii находились в фазе логарифмического роста, а их метаболиты проявляли антибактериальную активность. Когда рост S. boulardii достиг стационарной фазы, диаметр зоны подавления роста не изменился, что свидетельствует о стабильной концентрации антибактериального метаболита в середине ферментации.

Метаболомный анализ внеклеточных метаболитов

Штамм F15 существенно отличался от S. boulardii по своим пробиотическим свойствам. Поэтому сравнение метаболитов F15 с метаболитами S. boulardii в последующих экспериментах было полезно для оценки различий в метаболизме S. boulardii и S. cerevisiae. Кривые роста штамма F15 S. cerevisiae и S. boulardii представлены на рис. 4. Они показывают, что процесс роста двух видов дрожжей был примерно одинаковым. Через 40 ч абсорбция двух дрожжей почти не увеличивалась, то есть количество живых дрожжей достигало максимума через 40 ч, а через 40 ч начиналась фаза стабилизации. Через 48 часов количество жизнеспособных клеток S. boulardii и штамма F15 S. cerevisiae составило 8,68 ± 0,68 × 10⁷ и 9,02 ± 0,46 × 10⁷ кл/мл соответственно, и значимые различия отсутствовали (P > 0,05). Путем ферментации двух штаммов дрожжей в течение 44 часов мы получили метаболические экстракты для последующего анализа.

Для обнаружения метаболитов S. boulardii, F15 и неферментированных образцов для анализа метаболомики использовали СВЭЖХ-QE-МС. В общей сложности методом СВЭЖХ-QE-МС были идентифицированы 344 метаболита в режиме регистрации положительных ионов и 159 – в режиме регистрации отрицательных ионов. Чтобы снизить сложность данных и сохранить важную информацию о различиях, мы провели частичный анализ компонентов, который показал различия в площадях пиков различных метаболитов в трех образцах. В режиме регистрации отрицательных ионов обнаружены различия между тремя образцами в PC1 и PC2, которые объясняют общую дисперсию 69,6 и 26,4%, соответственно, при R2 > 0,961 и Q2 > 0,952 (рис. 5a). В режиме регистрации отрицательных ионов общая дисперсия PC1 и PC2 составила 59,8 и 27,5%, соответственно (рис. 5b), при R2 > 0,872 и Q2 > 0,837.

Метаболиты of S. boulardii

Используя OPLS-DA и S-plot в качестве инструментов метаболического скрининга (рис. 6), мы изучили отличительные метаболиты S. boulardii и штамма F15, обогащенные в ферментационном бульоне. Выделены группы Saccharomyces boulardii, F15 и неферментированных дрожжей. Параметрами для скрининга отличительных метаболитов служили значимость независимой переменной в проекции > 0,5, значение P < 0,05 и кратность изменений > 2 или < 0,5. В таблице S2 представлены метаболиты S. boulardii и штамма F15 S. cerevisiae. Среди этих метаболитов: органические кислоты, аминокислоты, углеводы, нуклеозиды, фенилпропаноиды, поликетиды и другие биологически активные соединения. Кроме того, идентифицированы некоторые первичные и вторичные метаболиты и конечные продукты метаболизма при ферментации S. boulardii. Выделено 10 типов основных метаболитов S. boulardii (рис. 7). 60% всех метаболитов составляли органические кислоты, 20,3% – гетероциклические соединения. За ними следовали фенольные и нуклеозидные соединения. В таблице 3 перечислены биологически активные метаболиты S. boulardii:1-аминоциклопропанкарбоновая кислота, 2-гидрокси-4-метилпентановая кислота, никотиновая кислота, фенилмолочная кислота (PLA), L-3-фенилмолочная кислота (L-3 -PLA), 4-гидроксифенилэтанол (тирозол), γ-аминомасляная кислота (ГАМК) и гарман, с указанием их функций.

Различия внеклеточных метаболитов S. boulardii и S. cerevisiae

S. boulardii, первые дрожжи с идентифицированным пробиотическим действием, широко использовали в исследованиях с участием людей. Поэтому изучение пробиотического потенциала S. boulardii и его отличий от S. cerevisiae поможет дифференцировать метаболические процессы этих двух видов дрожжей. Хотя метаболиты, продуцируемые S. boulardii, отличались от метаболитов, продуцируемых S. cerevisiae, эти два вида дрожжей имели общие метаболиты, отливавшие их от неферментированной среды. Чтобы более точно описать различия между S. boulardii и S. cerevisiae, метаболиты S. boulardii и штамма F15 S. cerevisiae анализировали на уровне метаболомики. Различия в их содержании и значимости можно визуализировать на кластерной тепловой карте (рис. 8). Хотя метаболиты двух видов дрожжей были схожими, их содержание было совершенно различным. Saccharomyces boulardii продуцировали больше соединений индола и производных пуринов, таких как индолацетальдегид, индолпируват, гипоксантин и тимин, среди прочих, тогда как S. cerevisiae продуцировали больше органических кислот и производных аминокислот, таких как лимонная кислота, яблочная кислота и γ-аминомасляная кислота. Кроме того, S. boulardii продуцируют больше фенольных кислот и нуклеозидов, таких как парааминобензойная кислота и инозин, тогда как S. cerevisiae, как правило, выделяют холин и бензоидные соединения, в том числе холин, бензойную кислоту и тирозол. Интересно, что S. boulardii продуцировал больше PLA и 2-гидрокси-4-метилпентановой кислоты, чем штамм F15.

Различия метаболических путей S. boulardii и S. cerevisiae

Для более полного понимания различий метаболических путей двух видов дрожжей все отличительные метаболиты были переданы в базу данных Энциклопедии генов и геномов Института химических исследований в Киото (KEGG) для анализа метаболических путей (рис. 9). Метаболические пути внеклеточных отличительных метаболитов в KEGG анализировали с использованием S. cerevisiae в качестве вида-сравнения. Основные пути метаболизма S. boulardii и штамма F15 S. cerevisiae различались. Помимо участия в цикле трикарбоновых кислот, метаболиты двух видов дрожжей принимали участие в биосинтезе парааминобензойной кислоты, метаболизме глицерофосфолипидов, метаболизме пуринов, метаболизме никотиновой кислоты и никотинамида, а также метаболизме ароматических аминокислот. Однако основные метаболические пути двух видов дрожжей, были разными. Вещества, принимающие участие в метаболизме глицерофосфолипидов, метаболизме глутамата, деградации тирозина и метаболизме метионина и гистидина, активировались, и их содержание в культурах S. cerevisiae было выше, чем в культурах S. boulardii. В отличие от метаболитов штамма F15 S. cerevisiae, метаболиты S. boulardii принимали участие в биосинтезе парааминобензойной кислоты, распаде триптофана и метаболизме пуринов. Кроме того, имели место различия между метаболическими путями двух видов дрожжей. Вследствие этих различий путей формировались различия в метаболических метаболизмов. Например, в процессе метаболизма глутамата S. cerevisiae будут использовать глутамат для синтеза большего количества ГАМК, тогда как S. boulardii могут производить больше N‑ацетилорнитина. В процессе метаболизма пуринов S. cerevisiae будут в основном синтезировать гипоксантин через аденин, а S. boulardii будут преимущественно производить инозин для синтеза ксантина. В процессе метаболизма аспарагиновой кислоты S. cerevisiae будут использовать аспарагиновую кислоту для синтеза никотиновой кислоты, а S. boulardii преимущественно будут синтезировать уридин.

Для того, чтобы оказать свое действие, пробиотики должны попасть в кишечник человека или животных [18], и устойчивость к желудочному соку с низким pH, солям желчных кислот и соли трипсина в кишечнике являются важными характеристиками при оценке устойчивости пробиотиков в желудочно-кишечном тракте. Результаты нашего исследования свидетельствуют о высокой устойчивости S. boulardii в симулированном желудочном соке. Hamza Goktas et al. [19] и Nagashima et al. [20] тоже сообщали о высокой способности S. boulardii к адаптации к условиям желудочно-кишечного тракта, которые подразумевают присутствие протеаз, солей желчных кислот и низкий рН. Хотя многие пробиотические дрожжи были тоже выделены из различных ферментированных пищевых продуктов или фруктов и овощей, они все же менее устойчивы к pH и солям желчных кислот, чем S. boulardii [21, 22]. Похожие исследования показали, что диапазон pH, к которому устойчивы S. boulardii, может достигать 2–7 [23], и такой широкий спектр устойчивости является преимуществом S. boulardii в качестве пробиотика, который используют в качестве добавки к продуктам с разными значениями pH. Соли желчных кислот оказывают противомикробное действие, повреждая клеточную мембрану и нарушая внутриклеточный гомеостаз [24], но некоторые пробиотики, такие как Lactococcus lactis, Lactiplantibacillus plantarum и Pichia pastoris, продуцируют гидролазы желчных солей (BSH), которые снижают токсичность солей желчных кислот [25, 26]. Согласно исследованиям, S. boulardii, как и молочнокислые бактерии, продуцирует BSH [27]. Это может обуславливать устойчивость S. boulardii к солям желчных кислот. Кроме того, мы обнаружили, что, как и было показано ранее, кишечная среда оказывала более сильное влияние на грибы рода Saccharomyces, чем среда желудка [23].

Пробиотики попадают в организм человека или животного и взаимодействуют друг с другом, что изначально зависит от поверхностных свойств грибов [28]. Виды грибов с выраженной гидрофобностью обычно обладают хорошей адгезией к клеткам слизистой оболочки, а способность клеток к аутоагрегации позволяет им создавать эффективную биомассу в кишечнике, обеспечивая преимущество в конкуренции с кишечной флорой [29]. Исследования показали, что для сохранения пробиотического эффекта S. boulardii необходимо принимать их внутрь постоянно, поскольку при прекращении приема пробиотиков они постепенно удаляются из кишечника [30]. Причиной такой необходимости могут быть сложные условия колонизации в кишечнике. Различная гидрофобность клеточной поверхности у разных видов дрожжей может зависеть от их специфических свойств [19]. Специфичность этих штаммов может определяться экспрессией белков клеточной стенки, составом углеводов на клеточной поверхности и реакцией клеток на микроокружение [31–33].

Антиоксидантное действие – одна из наиболее важных и желаемых характеристик, поскольку в предшествующих исследованиях было показано, что артрит, сердечно-сосудистые заболевания и некоторые опухоли возникают в результате продукции активных форм кислорода [34]. Многие пробиотики проявляют выраженную антиоксидантную активность [35, 36], как и S. boulardii. Интересно, что антиоксидантную активность проявляют не только сами клетки S. boulardii, но и метаболиты, образующиеся после ферментации.

Наше исследование показало, что метаболиты S. boulardii, помимо антиоксидантной активности, оказывают обширное антибактериальное действие. Антибактериальная активность метаболитов дрожжей определяется белковыми метаболитами (протеинфосфатаза, киллер-токсины, микоцины) [4, 37, 38] или органическими кислотами (уксусная кислота) [39]. Продукция этих уникальных соединений с антибактериальным действием зависит от специфических свойств S. boulardii [19, 40]. Исследования показали, что S. boulardii может продуцировать такие соединения с антибактериальным действием, как ванилиновая кислота, фенилэтиловый спирт и эритромицин [13], – это новый взгляд на антимикробные метаболиты S. boulardii; однако основные метаболиты этого вида дрожжей, обладающие антибактериальным действием, требуют дополнительного изучения.

Нецелевой метаболомный анализ показал, что S. boulardii продуцируют множество активных метаболитов. Среди органических кислот и их производных: 1‑аминоциклопропанкарбоновая кислота защищает нейроны от глутамат-индуцированной нейротоксичности, снижая активацию рецепторов N-метил_d-аспартата, и проявляет противосудорожное действие [41–43], а также может улучшать когнитивные функции [44]. 2-гидрокси-4-метилпентановая кислота, также известная как 2-гидроксиизокапроновая кислота (HICA), является производным лейцина и обладает обширным спектром антибактериального действия [45, 46]. Хорошо изучены свойства гаммааминомасляной кислоты (ГАМК). ГАМК в основном образуется в результате необратимой реакции α-декарбоксилирования ^l-глутаминовой кислоты или ее солей, катализатором которой выступает глутаматдекарбоксилаза. ГАМК используют при лечении бессонницы и депрессии [47]. В настоящее время большинство известных микроорганизмов, продуцирующих ГАМК, – это молочнокислые бактерии. Исследования дрожжей в этом отношении ограничены [48–50]. Шикимовая кислота является важным предшественником синтетических лекарств, витаминов и антибиотиков [51]. В процессе роста и метаболизма дрожжей многие аминокислоты превращаются в производные, например, ацетиламинокислоты. В ряде исследований было показано, что эти производные аминокислот имеют важное приложение. Ацилированные аминокислоты имеют собственный яркий вкус [52] и усиливают вкус других продуктов [53]. Метилированные аминокислоты играют важную роль в процессах конформации и обеспечении активности полипептидов. Метилирование полипептидов уменьшает их гибкость и усиливает их действие на клетки-реципиенты, что повышает их биологическую активность. Полипептиды, образованные N-метиламинокислотами, подавляют пролиферацию вирусов и рост опухолевых клеток, повышают иммунитет [54]. Основными биологически активными соединениями из классов бензоидов и фенилпропаноидов являются фенольные соединения – парааминобензойная кислота, тирозол, полимолочная кислота (PLA) и L-PLA. Фенолы играют важную роль в процессах окисления пищевых продуктов и защиты от него [55]. Парааминобензойная кислота – это промежуточное звено в процессе синтеза клетками дрожжей фолиевой кислоты (витамина B10); она является распространенным компонентом разнообразных лекарственных препаратов применения, например, антибактериальных и противоопухолевах препаратов, а также средств для коррекции нарушений моторики желудка и психических расстройств [56]. Тирозол обладает высокой антиоксидантной активностью и подавляет рост пищевых патогенов [57]; в определенных количествах тирозол способствует укреплению здоровья сердечно-сосудистой системы [58]. PLA является биологическим консервантом с высокой антибактериальной активностью с широким спектром антибактериального действия [59, 60] и может использоваться не только в качестве пищевого консерванта, но и как заменитель антибиотика в кормах для животных с целью предотвращения кишечных бактериальных инфекций и для повышения иммунитета [61]. L-PLA является энантиомером PLA и считается более сильным ингибитором, чем D-конфигурация [62]. Эти соединения в основном получают из растений, и число исследований соединений фенилпропионовой кислоты, продуцируемых дрожжами, не велико. Исследования показали, что ароматические пути у микроорганизмов схожи с таковыми у растений, например, такими как путь PLA у Lactiplantibacillus plantarum [63, 64]. Однако исследования соединений фенилпропионовой кислоты, продуцируемых дрожжами, требуют дальнейшего изучения. Глицерофосфохолин способен предотвращать связанное со старением снижение когнитивных функций и способствовать метаболизму липидов [65, 66]. Индол и его производные способствуют активизации генов, связанных с адгезией, и укрепляют кишечный барьер для предотвращения энтерита [67]. Серотонин, или 5-гидрокситриптамин, выполняет в желудочно-кишечном тракте важные регуляторные функции и принимает участие в регуляции гомеостаза глюкозы, метаболизма липидов, поддержании минеральной плотности костей и задействован в механизмах развития метаболических нарушений [68]. Никотиновая кислота, или витамин B3, является предшественником синтеза кофермента I (NAD⁺) и кофермента II (NADP⁺). Ниацин используется для лечения кожных заболеваний, таких как гиперпигментация, и атеросклероза [69]. Кроме того, ниацин является важным витамином, который широко используется в пищевых продуктах [70]. Среди алкалоидов, продуцируемых сахаромицетами – гарман – β-карболиновый алкалоид, который образуется из триптофана и антраниловой кислоты, и обладает противоопухолевой, антиоксидантной и антибактериальной активностью [71]. При ферментации Saccharomyces boulardii образуются метаболиты, которые полезны для организма человека или имеют функциональное значение. Они дополнительно повышают практическую ценность S. boulardii и целесообразность промышленного производства продуктов, содержащих S. boulardii.

Доступны исследования биологической активности низкомолекулярных метаболитов S. cerevisiae, таких как мелатонин, серотонин, гидрокситирозол [72], ароматические спирты [73] и полифенольные соединения [74]. Однако доступно лишь небольшое число исследований биологической активности метаболитов S. boulardii [13], в которых говорится об общем количестве метаболитов S. boulardii, определенном методом газовой хроматографии-МС. Как было показано ранее, S. boulardii может метаболизировать многие фенольные соединения, такие как ванилиновая кислота, коричная кислота и фенилэтиловый спирт. Мы же, напротив, мы не обнаружили эти метаболиты. Это различие результатов может быть связано с различиями в методах обнаружения и средах или характеристиками штамма.

Метаболические пути этих двух видов дрожжей отражают уникальную функцию и характеристики S. boulardii. Высокая активность этих метаболических путей говорит о том, что теоретически S. boulardii способны производить ряд активных метаболитов как клеточная фабрика. Хотя большинство соединений можно обнаружить и в метаболических путях S. cerevisiae, некоторые биологически активные метаболиты (например, HICA, PLA, L-3-PLA и харман) и механизмы их обмена у S. boulardii ранее не изучались. Исследования микроорганизмов, продуцирующих HICA, в основном сосредоточены на молочнокислых бактериях; HICA образуется из лейцина в результате реакции аминирования с образованием 2-кетоизогексановой кислоты (KICA), которая затем восстанавливается до HICA с участием гидроксиизокапроатдегидрогеназы (рис.10a) [75, 76]. HICA в больших количествах обнаружена в пробиотическом пиве, ферментированном с использованием молочнокислых бактерий и S. cerevisiae, но текущие исследования сосредоточены на корреляции между молочнокислыми бактериями и синтезом HICA [77]. Доступно небольшое число исследований по продукции HICA дрожжами. Наше исследование показало, что S. boulardii также могут продуцировать HICA в большом количестве. Это еще раз доказывает, что метаболиты S. boulardii обладают биологической активностью, однако соответствующий метаболический механизм требует дальнейшего изучения. Многие микроорганизмы продуцируют PLA, среди них наиболее изучены молочнокислые бактерии [78, 55, 79, 80]. Безусловно, известны и многие немолочнокислые бактерии, которые тоже продуцируют PLA, например, Bacillus coagulans [81], Geotrichum candidum [59] и Enterobacter cloacae [82]. Метаболические пути этих микроорганизмов, задействованные в синтезе PLA, представлены на рис.10b, трансаминирование фенилаланина до фенилпировиноградной кислоты осуществляется с участием трансаминазы, а восстановление фенилпировиноградной кислоты до PLA катализирует лактатдегидрогеназа. Аналогичный метаболический механизм также может иметь место у S. boulardii, но специфические метаболические пути требуют дальнейшего изучения с использованием методов мультиомики. Гарман является распространенным активным алкалоидом у растений, но описания связанных с ним метаболических путей у микроорганизмов немногочисленны, для этого необходимы дополнительные исследования.

Для понимания пробиотических характеристик внеклеточных метаболитов S. boulardii мы сравнили пробиотические свойства S. boulardii и S. cerevisiae. Способность к аутоагрегации и гидрофобность S. boulardii были относительно низкими, но дрожжи этого вида обладали более высокой устойчивостью к условиям желудочно-кишечного тракта, более выраженными антиоксидантными свойствами и демонстрировали широкий спектр антибактериального действия. Нецелевой метаболомный анализ показал, что S. boulardii продуцирует множество первичных и вторичных метаболитов и конечных продуктов метаболизма, включая, среди прочего, органические кислоты, аминокислоты и их производные, фенолокислоты, алкалоиды, нуклеозиды и витамины. Большинство из этих соединений улучшают вкус пищи, обладают антиоксидантным действием, усиливают активность белков, подавляют рост бактерий и оказывают противоопухолевое действие. При сравнении метаболитов S. boulardii и S. cerevisiae мы обнаружили некоторые различия. Было показано, что помимо общих метаболитов S. boulardii продуцируют индольные соединения, фенольные кислоты, нуклеозиды и производные пурина, тогда как S. cerevisiae продуцируют органические кислоты, производные аминокислот, холин и бензоидные соединения. Кроме того, различались и количества общих метаболитов. Пути, превращения этих метаболитов в целом были схожи, однако имел место ряд различий. Многие метаболиты S. boulardii принимали участие в биосинтезе парааминобензойной кислоты, деградации триптофана, метаболизме пуринов, а также метаболизме глицина, серина и треонина. Таким образом, мы провели всесторонний анализ пробиотических свойств S. boulardii, используя новый метод метаболомики без предварительно заданных мишеней. Этот метод используется только для скрининга активных метаболитов, генов и ферментов, задействованных в метаболизме видов-продуцентов, и полученные результаты требуют дальнейшей оценки в сочетании с методами других омик.

Использованные источники:

1. Canani RB, Cucchiara S, Cuomo R, Pace F, Papale F (2011) Saccharomyces boulardii: a summary of the evidence for gastroenterology clinical practice in adults and children. Eur Rev Med Pharmaco 15(7):809–822. PMID: 21780551

2. Rodrigues ACP, Nardi RM, Bambirra EA, Vieira EC, Nicoli JR (1996) Effect of Saccharomyces boulardii against experimental oral infection with Salmonella typhimurium and Shigella flexneri in conventional and gnotobiotic mice. J Appl Bacteriol 81:251–256. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1996.tb04325.x

3. Pothoulakis C, Kelly CP, Joshi MA, Gao N, O'Keane CJ, Castagliuolo I et al (1993) Saccharomyces boulardii inhibits Clostridium difficile toxin A binding and enterotoxicity in rat ileum. Gastroenterology 104:1108–1115. https://doi.org/10.1016/0016-5085(93)90280-P

4. Buts JP, Dekeyser N, Stilmant C, Delem E, Smets F, Sokal E (2006) Saccharomyces boulardii produces in rat small intestine a novel protein phosphatase that inhibits Escherichia coli endotoxin by dephosphorylation. Pediatr Res 60:24–29. https://doi.org/10.1203/01.pdr.0000220322.31940.29

5. Buts JP, De Keyser N, Marandi S, Hermans D, Sokal EM, Chae YH et al (1999) Saccharomyces boulardii upgrades cellular adaptation after proximal enterectomy in rats. Gut 45:89–96. https://doi.org/10.1136/gut.45.1.89

6. Lazo-Velez MA, Serna-Saldivar SO, Rosales-Medina MF, Tinoco- Alvear M, an Briones-Garcia, M. (2018) Application of Saccharomyces cerevisiae var. boulardii in food processing: A review. J Appl Microbiol 125:943–951. https://doi.org/10.1111/jam.14037

7. Rekha CR, Vijayalakshmi G (2010) Bioconversion of isoflavone glycosides to aglycones, mineral bioavailability and vitamin B complex in fermented soymilk by probiotic bacteria and yeast. J Appl Microbiol 109:1198–1208. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2010.04745.x

8. Ryan EP, Heuberger AL, Weir TL, Barnett B, Broeckling CD, Prenni JE (2011) Rice bran fermented with Saccharomyces boulardii generates novel metabolite profiles with bioactivity. J Agric Food Chem 59:1862–1870. https://doi.org/10.1021/jf1038103

9. Değirmencioğlu N, Gurbuz O, Şahan Y (2016) The monitoring, via an in vitro digestion system, of the bioactive content of vegetable juice fermented with Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardii. J Food Process Preserv 40:798–811. https://doi.org/10.1111/jfpp.12704

10. Hennequin C, Thierry A, Richard GF, Lecointre G, Nguyen HV, Gaillardin C et al (2001) Microsatellite typing as a new tool for identification of Saccharomyces cerevisiae Strains. J Clin Microbiol 39:551–559. https://doi.org/10.1128/JCM.39.2.551-559.2001

11. Mills DR (1941) Differential staining of living and dead yeast cells. J Food Sci 6:361–371. https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1941.tb16295.x

12. Diana C-R, Humberto H-S, Jorge YF (2015) Probiotic properties of leuconostoc mesenteroides isolated from Aguamiel of Agave salmiana. Probiotics Antimicro 7(2):107–117. https://doi.org/10.1007/s12602-015-9187-5

13. Datta S, Timson DJ, Annapure US (2017) Antioxidant properties and global metabolite screening of the probiotic yeast Saccharomyces cerevisiae var. boulardii. J Sci Food Agr 97(9):3039–3049. https://doi.org/10.1002/jsfa.8147

14. Wang Z, Zheng L, Li C, Wu S, Xiao Y (2017) Preparation and antimicrobial activity of sulfopropyl chitosan in an ionic liquid aqueous solution. J Appl Polym Sci 134(26). https://doi.org/10.1002/app.44989

15. Cai Y, Weng K, Guo Y, Peng J, Zhu Z-J (2015) An integrated targeted metabolomic platform for high-throughput metabolite profiling and automated data processing. Metabolomics 11:1575– 1586. https://doi.org/10.1007/s11306-015-0809-4

16. Wang J, Zhang T, Shen X, Liu J, Zhao D, Sun Y et al (2016) Serum metabolomics for early diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma by UHPLC-QTOF/MS. Metabolomics 12:116. https://doi.org/10.1007/s11306-016-1050-5

17. Smith CA, Want EJ, O'Maille G, Abagyan R, Siuzdak G (2006) XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Anal Chem 78:779–787. https://doi.org/10.1021/ac051437y

18. Czerucka D, Piche T, Rampal P (2007) Review article: yeast as probiotics – Saccharomyces boulardii. Aliment Pharmacol Ther 26(6):767–778. https://doi.org/10.1111/j.1365-2036.2007.03442.x

19. Goktas H, Dertli E, Sagdic O (2021) Comparison of functional characteristics of distinct Saccharomyces boulardii strains isolated from commercial food supplements. LWT- Food Sci Technol 136(2):110340. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.110340

20. Nagashima AI, Pansiera PE, Baracat MM, Gomez RJHC (2013) Development of effervescent products, in powder and tablet form, supplemented with probiotics Lactobacillus acidophilus and Saccharomyces boulardii. Food Sci Technol 33(4):605–611. https://doi.org/10.1590/S0101-20612013000400002

21. Motey GA, Johansen PG, Owusu-Kwarteng J, Ofori LA, Obiri- Danso K, Siegumfeldt H, Larsen N, Jespersen L (2020) Probiotic potential of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus isolated from West African spontaneously fermented cereal and milk products. Yeast 37:403–412. https://doi.org/10.1002/yea.3513

22. Pereira RP, Jadhav R, Baghela A et al (2021) In vitro assessment of probiotic potential of Saccharomyces cerevisiae DABRP5 isolated from Bollo batter, a traditional goan fermented food. Probiotics & Antimicro Prot 13:796–808. https://doi.org/10.1007/s12602-020-09734-8

23. Chelliah R, Kim EJ, Daliri BM, Antony U, Oh DH (2021) In vitro probitotic evaluation of Saccharomyces boulardii with antimicrobial spectrum in a caenorhabditis elegans model. Foods 10(6):1428. https://doi.org/10.3390/foods10061428

24. Begley M, Hill C, Gahan CG (2006) Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl Environ Microbiol 72:1729–1738. https://doi.org/10.1128/AEM.72.3.1729-1738.2006

25. Bi J, Liu S, Du G, Chen J (2016) Bile salt tolerance of lactococcus lactis is enhanced by expression of bile salt hydrolase thereby producing less bile acid in the cells. Biotechnol Lett 38(4):659–665. https://doi.org/10.1007/s10529-015-2018-7

26. Fernandez-Pacheco P, Ramos Monge IM, Fernandez-Gonzalez M, Poveda Colado JM, Arevalo-Villena M (2021) Safety evaluation of yeasts with probiotic potential. Front Nutr 8:659328. https://doi.org/10.3389/fnut.2021.659328

27. Hernandez-Gomez JG, Lopez-Bonilla A, Trejo-Tapia G, Avila- Reyes SV, Jimenez-Aparicio AR, Hernandez-Sanchez H (2021) In vitro bile salt hydrolase (BSH) activity screening of different probiotic microorganisms. Foods 10:674. https://doi.org/10.3390/foods10030674

28. Naito Y, Tohda H, Okuda K, Takazoe I (1993) Adherence and hydrophobicity of invasive and noninvasive strains of porphyromonas gingivalis. Mol Oral Microbiol. https://doi.org/10.1111/j.1399-302X.1993.tb00559.x

29. Bruckner S, Mosch HU (2012) Choosing the right lifestyle: adhesion and development in Saccharomyces cerevisiae. FEMS microbiol rev 36(1):25–58. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2011.00275.x

30. Kelesidis T, Pothoulakis C (2012) Efficacy and safety of the probiotic Saccharomyces boulardii for the prevention and therapy of gastrointestinal disorders. Ther adv in gastroenter 5:111–125. https://doi.org/10.1177/1756283X11428502

31. Hanano A, Shaban M, Almousally I, Al-Ktaifani M (2015) Saccharomyces cerevisiae SHSY detoxifies petroleum n-alkanes by an induced CYP52A58 and an enhanced order in cell surface hydrophobicity. Chemosphere 135:418–426. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2014.11.011

32. Ichikawa T, Hirata C, Takei M, Tagami N, Ikeda R (2017) Cell surface hydrophobicity and colony morphology of trichosporon asahii clinical isolates. Yeast 34(3):129–137. https://doi.org/10.1002/yea.3220

33. Shiradhone AB, Ingle SS, Zore GB (2018) Microenvironment responsive modulations in the fatty acid content, cell surface hydrophobicity, and adhesion of candida albicans cells. J Fungi (Basel, Switzerland) 4(2):47. https://doi.org/10.3390/jof4020047

34. Rosa SD, Cirillo P, Paglia A, Sasso L, Palma VD, Chiariello M (2010) Reactive oxygen species and antioxidants in the pathophysiology of cardiovascular disease: does the actual knowledge justify a clinical approach? Curr Vasc Pharmacol 8:259–275. https://doi.org/10.2174/157016110790887009

35. Shobharani P, Prakash M, Halami PM (2015) Probiotic bacillus spp. In soy‐curd: nutritional, rheological, sensory, and antioxidant properties. J Food Sci 80(10–12):M2247–M2256. https://doi.org/10.1111/1750-3841.13004

36. Feng T, Wang J (2020) Oxidative stress tolerance and antioxidant capacity of lactic acid bacteria as probiotic: a systematic review. Gut Microbes 12(1):1801944. https://doi.org/10.1080/19490976.2020.1801944

37. Golubev WI, Pfeiffer I, Golubeva EW (2006) Mycocin production in pseudozyma tsukubaensis. Mycopathologia 162(4):313–316. https://doi.org/10.1007/s11046-006-0065-2

38. Rima H, Steve L, Ismail F (2012) Antimicrobial and probiotic properties of yeasts: from fundamental to novel applications. Front Microbiol 3:421. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00421

39. Offei B, Vandecruys P, Graeve SD, Foulquie-Moreno MR, Thevelein JM (2019) Unique genetic basis of the distinct antibiotic potency of high acetic acid production in the probiotic yeast Saccharomyces cerevisiae var. boulardii. Genome Res 29:1478–1494. http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.243147.11...

40. Gut AM, Vasiljevic T, Yeager T, Donkor ON (2019) Characterization of yeasts isolated from traditional kefir grains for potential probiotic properties. J Funct Foods 58:56–66. https://doi.org/10.1016/j.jff.2019.04.046

41. Witkin JM, Tortella FC (1991) Modulators of N-methyl-D-aspartate protect against diazepam- or phenobarbital-resistant cocaine convulsions. Life Sci 48:L51–L56. https://doi.org/10.1016/0024-3205(91)90516-E

42. Fossom LH, Von Lubitz DKJE, Lin RCS, Skolnick P (1995) Neuroprotective actions of 1-aminocyclopropanecarboxylic acid (ACPC): a partial agonist at strychnine-insensitive glycine sites. Neurol Res 17:265–269

43. Nahum-Levy R, Fossom LH, Skolnick P, Benveniste M (1999) Putative partial agonist 1-aminocyclopropanecarboxylic acid acts concurrently as a glycine-site agonist and a glutamate-site antagonist at N-methyl-D-aspartate receptors. Mol Pharmacol 56:1207–1218. https://doi.org/10.1124/mol.56.6.1207

44. Popik P, Holuj M, Nikiforuk A, Kos T, Skolnick P (2014) 1‑Aminocyclopropanecarboxylic acid (acpc) produces procognitive but not antipsychotic-like effects in rats. Psychopharmacology 232: 1025–1038. https://doi.org/10.1007/s00213-014-3738-4

45. Sakko M, Tjaderhane L, Sorsa T, Hietala P, Jarvinen A, Bowyer P et al (2012) 2-Hydroxyisocaproic acid (HICA): a new potential topical antibacterial agent. Int J Antimicrob Agents 39:539–540. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2012.02.006

46. Sakko M, Moore C, Novak-Frazer L, Rautemaa V, Sorsa T, Hietala P et al (2014) 2-hydroxyisocaproic acid is fungicidal for Candida and Aspergillus species. Mycoses 57:214–221. https://doi.org/10.1111/myc.12145

47. Wu C, Huang Y, Lai X, Lai R, Zhao W, Zhang M et al (2014) Study on quality components and sleep-promoting effect of GABA Maoyecha tea. J Funct Foods 7:180–190. https://doi.org/10.1016/j.jff.2014.02.013

48. Masuda K, Guo XF, Uryu N, Hagiwara T, Watabe S (2008) Isolation of marine yeasts collected from the Pacific Ocean showing a high production of γ-aminobutyric acid. Biosci Biotechnol Biochem 72:3265–3272. https://doi.org/10.1271/bbb.80544

49. Song NE, Baik SH (2014) Identification and characterization of high GABA and low biogenic amine producing indigenous yeasts isolated from Korean traditional fermented Bokbunja (Rubus coreanus Miquel) wine. J Biotechnol 185:S83. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.07.285

50. Zhang Q, Sun Q, Tan X, Zhang S, Zeng L, Tang J et al (2020) Characterization of γ-aminobutyric acid (GABA)-producing Saccharomyces cerevisiae and coculture with Lactobacillus plantarum for mulberry beverage brewing. J Biosci Bioeng 129:447–453. https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2019.10.001

51. Nascimento Fraga L, Karoline de Souza Oliveira A, Pinheiro Aragao B, Alves de Souza D, Willian Propheta Dos Santos E, Alves Melo J et al (2021) Mass spectrometry characterization, antioxidant activity, and cytotoxicity of the peel and pulp extracts of Pitomba. Food Chem 340:127929. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127929

52. Ueda Y, Tsubuku T, Miyajima R (1994) Composition of sulfurcontaining components in onion and their flavor characters. Biosci Biotechnol Biochem 58:108–110. https://doi.org/10.1271/bbb.58.108

53. Xiaogen Y, Elisabetta L, Harry R, Alexander TP, Stephan H, Xinping L, Xun F (2013) Flavour modifying compounds. WO/2013/010991 http://www.freepatentsonline.com/WO2013010991.html

54. Li Y, Bionda N, Yongye A, Geer P, Stawikowski M, Cudic P et al (2013) Dissociation of antimicrobial and hemolytic activities of gramicidin S through N-methylation modification. Chem Med Chem 8:1865–1872. https://doi.org/10.1002/cmdc.201300232

55. Valerio F, Lavermicocca P, Pascale M, Visconti A (2004) Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation. FEMS Microbiol Lett 233:289–295. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2004.tb09494.x

56. Kluczyk A, Popek T, Kiyota T, de Macedo P, Stefanowicz P, Lazar C et al (2002) Drug evolution: p-aminobenzoic acid as a building block. Curr Med Chem (CMC) 9:1871–1892. https://doi.org/10.2174/0929867023368872

57. Casadey R, Challier C, Altamirano M, Spesia MB, Criado S (2020) Antioxidant and antimicrobial properties of tyrosol and derivativecompounds in the presence of vitamin b2. Assays of synergistic antioxidant effect with commercial food additives. Food Chem 335(8):127576. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127576

58. Boronat A, Mateus J, Soldevila-Domenech N, Guerra M, Rodriguez- Morato J, Varon C, Munoz D, Barbosa F, Morales JC, Gaedigk A, Langohr K, Covas M-I, Perez-Mana C, Fito M, Tyndale RF, de la Torre R (2019) Cardiovascular benefits of tyrosol and its endogenous conversion into hydroxytyrosol in humans. A randomized, controlled trial. Free Radical Bio Med 143:471–481. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2019.08.03...

59. Dieuleveux V, Van Der Pyl D, Chataud J, Gueguen M (1998) Purification and characterization of anti-listeria compounds produced by Geotrichum candidum. Appl Environ Microbiol 64:800–803. https://doi.org/10.1128/AEM.64.2.800-803.1998

60. Dao Y, Zhang K, Lu X, Lu Z, Liu C, Liu M et al (2019) The role of glucose and 2-oxoglutarate/malate translocator (OMT1) in the production of phenyllactic acid and p hydroxyphenyllactic acid, two food-borne pathogen inhibitors. J Agric Food Chem 67:5820–5826. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b01444

61. Wang JP, Yoo JS, Lee JH, Jang HD, Kim HJ, Shin SO et al (2009) Effects of phenyllactic acid on growth performance, nutrient digestibility, microbial shedding, and blood profile in pigs. J Anim Sci 87:3235–3243. https://doi.org/10.2527/jas.2008-1555

62. Svanstrom A, Boveri S, Bostrom E, Melin P (2013) The lactic acid bacteria metabolite phenyllactic acid inhibits both radial growth and sporulation of filamentous fungi. BMC Res Notes 6(1):1–9. https://doi.org/10.1186/1756-0500-6-464

63. Prema P, Smila D, Palavesam A, Immanuel G (2010) Production and characterization of an antifungal compound (3-phenyllactic acid) produced by Lactobacillus plantarum strain. Food Bioprocess Technol 3:379–386. https://doi.org/10.1007/s11947-008-0127‑1

64. Yu S, Jiang H, Jiang B, Mu W (2012) Characterization of D-lactate dehydrogenase producing D-3-phenyllactic acid from Pediococcus pentosaceus. Biosci Biotechnol Biochem 76:853–855. https://doi.org/10.1271/bbb.110955

65. Kawamura T, Okubo T, Sato K, Fujita S, Goto K, Hamaoka T et al (2012) Glycerophosphocholine enhances growth hormone secretion and fat oxidation in young adults. Nutrition 28(11-12): 1122-1126. https://doi.org/10.1016/j.nut.2012.02.011

66. Narukawa M, Kamiyoshihara A, Izu H, Fujii T, Misaka T (2020) Efficacy of long-term feeding of α-glycerophosphocholine for aging-related phenomena in old mice. Gerontology 66(3):1–11. https://doi.org/10.1159/000504962

67. Bansal T, Alaniz RC, Wood TK, Jayaraman A (2010) The bacterial signal indole increases epithelial-cell tight-junction resistance and attenuates indicators of inflammation. P Natl Acad of Sci US 107(1):228–233. https://doi.org/10.1073/pnas.0906112107

68. Martin AM, Young RL, Leong L, Rogers GB, Spencer NJ, Jessup CF, Keating DJ (2017) The diverse metabolic roles of peripheral serotonin. Endocrinology 158:1049–1063. https://doi.org/10.1210/en.2016-1839

69. Surjana D, Damian DL (2011) Nicotinamide in dermatology and photoprotection. Skinmed 9(6):360–365. PMID: 22256624

70. Joseph A, Bernardes CES, da Piedade MEM (2012) Heat capacity and thermodynamics of solid and liquid pyridine-3-carboxylic acid (nicotinic acid) over the temperature range 296 K to 531 K. J Chem Thermodyn 55:23–28. https://doi.org/10.1016/j.jct.2012.06.010

71. Xie Z, Cao N, Wang C (2021) A review on β-carboline alkaloids and their distribution in foodstuffs: a class of potential functional components or not? Food Chem 348:129067. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129067

72. Gallardo-Fernandez M, Valls-Fonayet J, Valero E, Hornedo- Ortega R, Richard T, Troncoso AM, Garcia-Parrilla MC (2022) Isotopic labelling-based analysis elucidates biosynthesis pathways in Saccharomyces cerevisiae for melatonin, serotonin and hydroxytyrosol formation. Food Chem 374:131742. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.131742

73. Liu S, Bai M, Zhou J, Jin Z, Xu Y, Yang Q, Zhou J, Zhang S, Mao J (2022) Analysis of genes from Saccharomyces cerevisiae HJ01 participating in aromatic alcohols biosynthesis during huangjiu fermentation. LWT-Food Sci Technol 154:112705. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.112705

74. Chrzanowski G (2020) Saccharomyces cerevisiae-an interesting producer of bioactive plant polyphenolic metabolites. Int J Mol Sci 21: 7343. https://doi.org/10.3390/ijms21197343

75. Fernandez M, Zuniga M (2006) Amino acid catabolic pathways of lactic acid bacteria. Crit Rev Mcrobip 32(3):155. https://doi.org/10.1080/10408410600880643

76. Park B, Hwang H, Chang JY, Hong SW, Lee SH, Jung MY, Sohn SO, Park HW, Lee JH (2017) Identification of 2-hydroxyisocaproic acid production in lactic acid bacteria and evaluation of microbial dynamics during kimchi ripening. Sci Rep 7:10904. https://doi.org/10.1038/s41598-017-10948-0

77. Loh LX, Ng DHJ, Toh M, Lu Y, Liu SQ (2021) Targeted and nontargeted metabolomics of amino acids and bioactive metabolites in probiotic-fermented unhopped beers using liquid chromatography high-resolution mass spectrometry. J Agr Food Chem 69:14024–14036. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c03992

78. Magnusson J (2003) Antifungal activity of lactic acid bacteria. Acta Universitatis Agriculturae Sueciae Agraria

79. Li X, Ning Y, Liu D, Yan A, Wang Z, Wang S, Miao M, Zhu H, Jia Y (2015) Metabolic mechanism of phenyllactic acid naturally occurring in chinese pickles. Food Chem 186:265–270. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.01.145

80. Schmidt M, Lynch KM, Zannini E, Arendt EK (2017) Fundamental study on the improvement of the antifungal activity of lactobacillus reuteri r29 through increased production of phenyllactic acid and reuterin. Food Control 88:139–148. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.11.041

81. Zheng Z, Ma C, Gao C, Li F, Qin J, Zhang H et al (2011) Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells of bacillus coagulans sdm. PLoS ONE 6(4):e19030. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019030

82. Liu F, Wang F, Du L, Zhao T, Doyle MP, Wang D et al (2017) Antibacterial and antibiofilm activity of phenyllactic acid against enterobacter cloacae. Food Control 84:442–448. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.09.004

Примечание издателя: Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юридических претензий к опубликованным данным и принадлежности к учреждениям и организациям.