Задача – основная цель этого исследования заключалась в определении чувствительности in vitro штаммов, собранных из продаваемых пробиотиков, к антибиотикам, используемым для лечения внебольничных инфекций.
Методы – минимальные ингибирующие концентрации (МИК) 16 антибиотиков определяли с использованием градиентной полосы (E-тест) или метода разведения агара для фидаксомицина.
Результаты – пробиотики продемонстрировали различную чувствительность к антибиотикам. Бактериальные пробиотики обычно чувствительны к большинству назначаемых антибиотиков, вводимых перорально, тогда как дрожжевые пробиотики, такие как Saccharomyces boulardii, обычно резистентны.
Вывод – особое внимание должно быть уделено совместным назначениям антибиотиков и пробиотиков для обеспечения того, чтобы пробиотический штамм не был чувствительным. © 2017 Elsevier Masson SAS. Все права защищены.

Ключевые слова: чувствительность к антибиотикам; пробиотики

Антибиотики являются наиболее эффективными препаратами для лечения бактериальных инфекций. Однако одним из наиболее распространенных нежелательных явлений, связанных с антибиотиками, остается диарея: так называемая антибиотик-ассоциированная диарея (ААД), которая возникает в 5–39 % случаев [1, 2]. Средняя продолжительность ААД составляет приблизительно семь дней, но это состояние может длиться до 10 дней или дольше у 19 % пациентов, получающих антибиотики [3].
Если возможно, лечение антибиотиками прекращается; однако в большинстве клинических ситуаций тяжесть инфекции или сопутствующих заболеваний требует дальнейшего лечения, что приводит к увеличению продолжительности пребывания в больнице, увеличению расходов на медицинское обслуживание и увеличению количества диагностических процедур [4].
В дополнение к лечению бактериальных инфекций использование антибиотиков широкого спектра действия приводит (в качестве побочного повреждения) к нарушению защитной микробиоты хозяина, что в свою очередь приводит к ААД [4]. Чем более серьезным является изменение микробиоты кишечника данным антибиотиком, тем более вероятно, что это приведет к ААД.
ААД может позволить условно-патогенным микроорганизмам колонизировать кишечник, также может привести к повышенной чувствительности и к последующему заболеванию. Особое значение имеет диарея, ассоциированная с Clostridium difficile, (CDAD), которая встречается примерно у 20 % пациентов с ААД. Такие пациенты заразились более тяжелыми заболеваниями из-за этого опасного для жизни патогена [1, 2, 5].
Чрезмерное или ненадлежащее использование антибиотиков привело к появлению резистентных бактерий и расширению возможностей горизонтального переноса генов, что имеет серьезные последствия для возникновения резистентности [6].
Пробиотики являются одним из подходов к сохранению резистентности к колонизации и сокращению количества случаев ААД. Использование пробиотиков могут предлагать врачи общей практики и фармацевты. Пробиотики – это живые организмы, которые при их применении в достаточных количествах улучшают здоровье хозяина [7]. Выпущены рекомендации по применению пробиотиков. Европейское Общество детской гастроэнтерологии, гепатологии и питания и Североамериканское Общество детской гастроэнтерологии (ESPGHAN) рекомендуют использовать два пробиотика для профилактики ААД у детей: дрожжи Saccharomyces boulardii и бактерию Lactobacillus rhamnosus GG [8]. Для профилактики диареи, ассоциированной с Clostridium difficile, рекомендуется только S. boulardii.
Воздействия антибиотиков на патогенные бактерии подробно изучались, хотя лишь немногие исследования были сосредоточены на пробиотических бактериях. Более того, хотя эти исследования направлены на описание чувствительности возможных новых пробиотических штаммов, специалистам здравоохранения не хватает информации о чувствительности к антибиотикам коммерчески доступным пробиотиков [9]. Действительно, мы не смогли найти литературные данные об уровне резистентности этих пробиотических изолятов к антибиотикам, которые относятся к числу наиболее часто назначаемых антибиотиков против внебольничных инфекций.
Поэтому мы определили антибиотическую чувствительность 16 бактериальных штаммов вместе с одним штаммом грибкового происхождения к панели из 16 выбранных антибиотиков. Фидаксомицин добавляли и изучали отдельно, потому что этот препарат используется для лечения тяжелой диареи из-за выработки токсинов

2.1. Штаммы

Штаммы, используемые в этом исследовании, были выделены из основных продаваемых пробиотиков (зарегистрированных лекарств или пищевых добавок); они перечислены в Таблице 1. Чистоту штаммов вновь проверяли перед проведением теста на антимикробную чувствительность. В качестве контрольных штаммов добавили Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 и Bacteroides fragilis ATCC 25285.

2.2. Подготовка посевного материала

Каждый изолят субкультивировали в бульоне Mueller Hinton для аэробных бактерий (24 часа), как рекомендовано Европейским комитетом по тестированию на чувствительность к антибиотикам (EUCAST) [10], и в бульоне Brucella (Дифко, Бектон Дикинсон, Ле Пон-де-Кле, Франция) для строгих анаэробов (48 часов), как рекомендовано Институтом клинических лабораторных стандартов (CLSI) [11].
Окончательный посев был получен путем разбавления предыдущих субкультур в тех же жидких средах до мутности, равной 1 стандарту МакФарланда (ок. 1 до 1,5 х 108 КОЕ/мл).

2.3. Засев чашек и определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)

Используя ватный тампон, предыдущую суспензию рассевали на кровяной агар Columbia (5 % лошадиной крови) и через 5 минут сушки на поверхность агара помещали тест-полоску E (БиоМерье, Франция). В случае аэробных бактерий чашки инкубировали при 36–37 °С в течение 24 часов, а анаэробные штаммы инкубировали в анаэробной камере (Don Whitley, AES, Комбур, Франция) при 35–36 °C в течение 48 часов. Кровяной агар Columbia – среда, рекомендованная производителем E-теста. Наивысшая концентрация по шкале для каждой отдельной тест-полоски E соответствовала самой высокой концентрации.

2.4. Определение МИК фидаксомицина

Фидаксомициновые полоски еще не продаются, поэтому мы определили МИК фидаксомицина с использованием эталонного метода разведения агара (M11A7 из CLSI). Посевной материал готовили в бульоне Brucella путем разбавления 48-часовой субкультуры до мутности, равной 0,5 стандарта МакФарланда. Штаммы рассевали на агар Brucella, дополненный 5%-й лизированной лошадиной кровью. Для получения посевного материала плотностью около 105 КОЕ/точку использовали инокулятор Mast Multipoint. Считывание проводили после 48 часов инкубации при 35 °С в анаэробной камере Don Whitley.

2.5. Тестирование на антибиотики и клиническая классификация штаммов

Определили МИК 13 самых назначаемых антибиотиков при внебольничных инфекциях: бензилпенициллин; оксациллин (изоксазолил пенициллин); амоксициллин (аминопенинциллин) самостоятельно или в сочетании с клавулановой кислотой; цефуроксим (цефалоспорин второго поколения); цефподоксим и цефиксим (пероральные цефалоспорины третьего поколения); кларитромицин и азитромицин (макролиды); клиндамицин (линкозамид); хинупристин/дальфопристин (стрептограминовый аналог перорального пристинамицина); ципрофлоксацин и левофлоксацин (фторхинолоны); доксициклин (тетрациклин); ко-тримоксазол (комбинация триметоприма и сульфаметоксазола, сульфонамид) и метронидазол (5 нитроимидазола). Штаммы классифицировали как чувствительные или резистентные в соответствии с их границами резистентности по определению EUCAST [12].
Фидаксомицин, антибиотик, используемый главным образом в больницах для лечения диареи и псевдомембранозного колита, связанных с продуцированием токсина C. difficile, тестировали отдельно. Пока еще невозможно выполнить клиническую классификацию фидаксомицина, поскольку EUCAST решил не определять границу резистентности из-за изменения МИК от исследования к исследованию. Низкая растворимость в воде или бульонных средах препятствует исследователям определять МИК > 128 мг/л.

Активность 7 β-лактамов и 9 других антибиотиков против испытуемых изолятов показана в Таблицах 2 и 3. МИК фидаксомицина для испытуемых штаммов варьировались от 0,5 до 64 мг/л (Таблица 4).

3.1. Активность антибиотиков против Lactobacillus spp.

Один штамм L.reuteri был резистентен к пенициллинам и цефалоспоринам третьего поколения, но оставался чувствительным к цефуроксиму. Другие изоляты Lactobacillus были чувствительны к бензилпенициллину, амоксициллину и цефуроксиму и, за исключением одного штамма, были резистентны к цефалоспоринам третьего поколения. К оксациллину, антистафилококковому пенициллину, наблюдалась резистентность в низких концентрациях (МИК 2-8 мг/л); а MLSb-резистентный фенотип (резистентный к кларитромицину, азитромицину и клиндамицину и чувствительный к стрептограмину) наблюдался у 2 из 8 испытуемых штаммов. Большинство изолятов были резистентны как к ципрофлоксацину, так и к левофлоксацину. Один изолят был резистентен к доксициклину.
Была подтверждена первичная резистентность к метронидазолу и ко-тримоксазолу, присущая Lactobacillus.

3.2. Активность антибиотиков против штамма Lactococcus lactis

Изолят был чувствителен ко всем β-лактамам (кроме цефиксима), при этом был резистентен к ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу и метронидазолу.

3.3. Активность антибиотиков против Bacillus spp.

Все штаммы были чувствительны ко всем пенициллинам (за исключением оксациллина), фторхинолонам (ципрофлоксацину и левофлоксацину), стрептограмину, доксициклину и ко-тримоксазолу. Как обычно, штаммы Bacillus были резистентны к цефалоспоринам, макролидам, клиндамицину и метронидазолу.

3.4. Активность антибиотиков против штамма Streptococcus thermophilus

Штамм чувствителен ко всем проверенным антибиотикам, за исключением метронидазола (первичная резистентность).

3.5. Активность антибиотиков против Bifidobacterium spp.

Три штамма были резистентны к ципрофлоксацину, но чувствительны к левофлоксацину. Они были чувствительны ко всем другим проверенным антибиотикам, включая метронидазол, за исключением двух штаммов, резистентных к цефалоспоринам третьего поколения, и одного штамма, резистентного к доксициклину.
3.6. Активность антибиотиков против S. boulardii
Что характерно для дрожжей, штамм был естественно резистентен ко всем проверенным антибиотикам.

Антибиотики могут вызывать дисбактериоз микробиоты кишечника и привести к ААД. Пробиотики, обычно используемые для предотвращения ААД, являются живыми непатогенными бактериями, которые могут выжить в кишечнике человека и помочь восстановить эубиоз микробиоты. Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить с помощью исследования in vitro, может ли потребление антибиотиков влиять на жизнеспособность пробиотиков.
Наши результаты сопоставляются с литературными данными [13] и недавним обзором пробиотических штаммов [14] о чувствительности к антибиотикам различных изолятов, изученных в этом исследовании. Совместное введение пробиотика бактериального происхождения и одного из 16 исследованных антибиотиков привело к чувствительности пробиотика в 170 из 272 случаев (62 %, рассчитанных на основе данных Таблицы 5). В отличие от S. boulardii, эукариотического пробиотического штамма, ни один из пробиотиков бактериального происхождения не был резистентен ко всем испытуемым антибиотикам (рис. 1).
Пробиотики в основном резистентны к оксациллину и метронидазолу. У оксациллина и метронидазола узкий спектр активности, в основном против Staphylococcus и Streptococcus у оксациллина; однако активность метронидазола ограничена строгими анаэробами. Поэтому эти два препарата имеют ограниченное воздействие на микробиоту, в которой потребности пробиотиков могут быть самыми небольшими. Если сравнить результаты, полученные для этих антибиотиков, бактериальные пробиотики оказались чувствительны в 159 из 238 случаев (67 %). Если рассматривать восемь наиболее используемых (амоксициллин, амоксициллин + клавулановая кислота, цефуроксим, азитромицин, кларитромицин, пристинамицин, ципрофлоксацин и левофлоксацин), чувствительность возникает в 102 из 136 случаев (75 %).
Фидаксомицин представляет собой новое средство с узким спектром действия, которое, как было продемонстрировано, избирательно активно против грамположительных анаэробов, включая основной этиологический возбудитель ААД, C. difficile. Учитывая его высокую стоимость, этот препарат используется для лечения инфекций C. difficile, когда предыдущее лечение пероральным ванкомицином либо метронидазолом окончилось неудачей. Поскольку EUCAST решил не определять границу резистентности для фидаксомицина, мы не смогли определить, были ли испытуемые пробиотики чувствительными или резистентными. Однако из-за высоких доз, обычно встречающихся в кишечнике (1000 мкг/мл) [15], можно предположить, что фидаксомицин, бактерицидная активность которого проявляется в концентрации 4 х МИК, может убить большую часть пробиотиков, изучаемых здесь, если они вводятся совместно.

EUCAST определяет клинические границы резистентности на основе концентрации антибиотиков в крови. Граница резистентности Ч/П обычно основана на стандартной дозе, а граница резистентности П/Р основана на максимальной дозе. Резистентность/чувствительность изолятов определяли на основе этих границ. Однако концентрации антибиотиков в кишечнике обычно выше; например, наблюдаемая концентрация цефиксима в фекалиях у пациентов составляла 237–912 мкг/г, тогда как его граница резистентности намного ниже – 1 мг/л [16]. Результаты этого исследования in vitro свидетельствуют о том, что пробиотики, классифицированные как резистентные штаммы, могут быть убиты in situ, исходя из высокой концентрации этих пероральных антибиотиков в кишечнике.
Согласно официальному определению, пробиотики представляют собой «живые микроорганизмы, которые при введении в достаточных количествах приносят пользу здоровью хозяина» [7]. В идеале пробиотический штамм не зависит от сопутствующих лекарств или антибиотиков, принимаемых одновременно с пробиотиком. Например, S. boulardii можно вводить одновременно с пероральными антибиотиками, потому что на него влияют только противогрибковые препараты (не антибиотики) [17].
Тем не менее, пробиотики многообразны, а пробиотический парадокс состоит в том, что как живые, так и мертвые клетки в пробиотических продуктах могут давать полезные биологические ответы [7]. Однако этот парадокс может не относиться к ААД, потому что живые пробиотические клетки влияют как на микробиоту желудочно-кишечного тракта, так и на иммунный ответ, тогда как компоненты мертвых клеток оказывают противовоспалительный ответ в желудочно-кишечном тракте [18]. Кроме того, доза и режим введения имеют решающее значение для пробиотиков, которые попадают в организм как продукты, заявляемые как полезные для здоровья или используемые в качестве лекарств в клиниках [19]. Таким образом, даже если высокие концентрации антибиотиков в кишечнике не будут убивать всю дозу пробиотиков, оставшиеся пробиотики, вероятно, не будут достаточными для выполнения своей функции (даже частично).
Необходимы дальнейшие исследования in vitro для определения резистентности, жизнеспособности и эффективности пробиотиков в присутствии антибиотиков в концентрациях, характерных для кишечника, а также определение уровня пробиотиков при совместном применении с антибиотиками даже с двухчасовой задержкой.

Совместное введение антибиотиков и изолятов бактериального происхождения может не оказывать профилактического действия на ААД. По сравнению с бактериальными пробиотиками особый интерес представляют пробиотические дрожжи S. boulardii, они могут быть назначены совместно с пероральными антибиотиками без ущерба. Следовательно, этот подход предотвращает возможности горизонтального переноса генов. В этом исследовании подчеркивается, что бактериальные пробиотики обычно чувствительны к большинству назначаемых антибиотиков, вводимых перорально. Кроме того, особое внимание должно быть уделено совместным назначениям антибиотиков и пробиотиков для обеспечения того, чтобы пробиотический штамм не был чувствительным.

Вклад авторов
С. Мэхиукс выполнил эксперименты под руководством К. Неута.
К. Неут, Л. Дабройль и спонсор исследования интерпретировали результаты (две интерпретации).

Финансирование
Это исследование финансировалось компанией Biocodex, Франция, которая принимала участие в разработке исследования и написании статьи.

Раскрытие интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы
[1] Wiström J, Norrby SR, Myhre EB, Eriksson S, Granström G, Lagergren L, et al. Frequency of antibiotic-associated diarrhoea in 2462 antibiotic-treated hospitalized patients: a prospective study. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 43-50.
[2] McFarland LV. Epidemiology, risk factors and treatments for antibiotic-associated diarrhea. Dig Dis 1998; 16: 292-307.
[3] Ropion V. Les antibiotiques les effets indésirables et les Français. Une enquête IPSOS; 2015 [Available at: http://microbiote.lequotidiendumedecin.fr/Biocodexinfo_antibio_V22 %20signee.pdf (accessed May 2016)].
[4] McFarland LV. Antibiotic-associated diarrhea: epidemiology, trends and treatment. Future Microbiol 2008; 3: 563-78, http://dx. doi.org/10.2217/174609133.5.563.
[5] Katz JA. Probiotics for the prevention of antibiotic-associated diarrhea and Clostridium difficile diarrhea. J Clin Gastroenterol 2006; 40: 249-55.
[6] Modi SR, Collins JJ, Relman DA. Antibiotics and the gut microbiota. J Clin Invest 2014; 124: 4212-8.
[7] Hill C, Guarner F, Reid G, Gibson GR, Merenstein DJ, Pot B, et al. Expert consensus document. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2014; 11: 506-14.
[8] Szajewska H, Canani RB, Guarino A, Hojsak I, Indrio F, Kolacek S, et al. Probiotics for the prevention of antibiotic-associated diarrhea in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2016; 62: 495-506.
[9] Polka J, Morelli L, Patrone V Microbiological cuttoff values: a critical issue in phenotypic antibiotic resistance assessment of Lactobacilli and bifidobacteria. Microbial Drug resistance 2016; 22: 696-9.
[10] European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Antimicrobial susceptibility testing (v 4.0); 2014 [Available at: http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/ (accessed October 2014)].
[11] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria; approved standard. 7th ed Wayne, PA: CLSI; 2007 [Document M11-A7].
[12] European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, version 5.0; 2015 [Available at: http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/ (accessed October 2015)].
[13] Lorian V, editor. Antibiotics in laboratory medicine. 2nd ed. Baltimore: Williams and Wilkins; 1986.
[14] Sharma P, Tomar SK, Goswani P, Sangwan V, Singh R. Antibiotic resistance among commercially available probiotics. Food Res Int 2014; 57: 176-95.
[15] Sears P, Crook DW, Louie TJ, Miller MA, Weiss K. Fidaxomicin attains high fecal concentrations with minimal plasma concentrations following oral administration in patients with Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis 2012; 55 (Suppl. 2): S116-20.
[16] Nord CE, Movin G, Stålberg D. Impact of cefixime on the normal intestinal microflora. Scand J Infect Dis 1988; 20: 547-52.
[17] McFarland LV. From yaks to yogurt: the history, development, and current use of Probiotics. Clin Infect Dis 2015; 60 (Suppl. 2): S85-90.
[18] Adams CA. The probiotic paradox: live and dead cells are biological response modifiers. Nutr Res Rev 2010; 23: 37-46.
[19] Bertazzoni E, Donelli G, Midtvedt T, Nicoli J, Sanz Y. Probiotics and clinical effects: is the number what counts? J Chemother 2013; 25: 193-212.